Powielanie DNA bez klonowania - PCR

Klonowanie molekularne genowego DNA umożliwia osiągnięcie dwóch głównych celów. Po pierwsze – oddzielenie dowolnego segmentu DNA od pozostałych, po drugie – powielenie wybranych odcinków DNA. Po sklonowaniu określonego genu lub regionu DNA i poznaniu jego sekwencji często można wykrywać niektóre rodzaje mutacji dzięki zmianie wzoru prążków, powstającego w wyniku pocięcia DNA przez różne enzymy restrykcyjne, przeniesieniu na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzacji. Jest to możliwe w przypadku większości zmian w DNA, polegających na utracie par zasad (delecji), wstawieniu nowych (insercji) lub ich rearanżacji. W ten sposób da się wykryć nawet zmianę pojedynczej pary zasad, o ile zmiana ta eliminuje lub tworzy miejsce rozpoznawane przez jeden lub kilka enzymów restrykcyjnych.

PCR (z ang.: polymerase chain reaction – łańcuchowa reakcja polimerazy) umożliwia syntezę milionów kopii każdej sekwencji genomowego DNA w czasie krótszym niż kilka godzin. Istotną zaletą tej techniki jest fakt, że wybrany do powielania segment DNA nie musi być oddzielony od reszty genomowego DNA przed rozpoczęciem amplifikacji. Po powieleniu segment z łatwością daje się oddzielić od reszty genomowego DNA (który nie został powielony) dzięki elektroforezie na żelu. Jej podstawowym celem jest równoczesne kopiowanie dwóch komplementarnych nici DNA w wybranym regionie. Początkowo więc obie nici poddaje się denaturacji (rozpleceniu) przez podgrzanie. Następnie pojedyncze nici miesza się z dużą ilością dwóch rodzajów krótkich jednoniciowych.

W pewnym sensie procedura PCR zastępuje klonowanie, ponieważ sekwencję nukleotydową można określić bezpośrednio na powielonym fragmencie. Można również wykrywać i lokalizować zmiany sekwencji porównując zdolności powielonego segmentu do łączenia się z nie zmutowaną sekwencją.

Taka analiza umożliwia badania przesiewowe DNA poszczególnych osobników na występowanie lub nieobecność częstych mutacji w znanych genach. PCR ułatwia również klonowanie odcinków DNA, które występują w genomie bardzo rzadko, a nawet genów, które są znane jedynie na podstawie sekwencji aminokwasowej kodowanego białka.

Metodę PCR wykorzystuje się obecnie powszechnie do wykrywania infekcji wirusowych, również obecności wirusa HIV-1 we krwi pacjentów chorych na AIDS (lub podejrzewanych o chorobę); do badania samoczynnie powstających nowotworów ludzkich, aby określić ewentualne zmiany w sekwencji genów kontrolujących wzrost i podział komórek, oraz przed przeszczepieniami, do określania typu genów, od których zależy układ zgodności tkankowej.

Tę samą procedurę można wykorzystać do powielenia segmentu cząsteczki RNA, jeśli RNA został najpierw skopiowany na dwuniciowy DNA przez odwrotną transkryptazę. Technika PCR umożliwiła również analizę sekwencji mRNA transkrybowanego ze zmutowanego lub interesującego z innych względów genu.

Połączenie szybkości, czułości i wybiórczości uczyniło z PCR znakomitą metodę badania struktury różnych alleli genu w sytuacjach, w których nie można uzyskać dużej ilości materiału.

Biolog.pl, Elżbieta Grudzińska